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浅析丹参对持续癫痫幼鼠脑损伤后血清NSE影响的实验研究
【关键词】 丹参；惊厥性脑损伤；神经元特异性烯醇化酶
摘要：目的探讨丹参对持续癫痫幼鼠脑神经元损伤可能具有的保护作用及其机制。方法美解眠诱发健康幼龄大鼠癫痫持续状态发作。随机分组后分批处死。电镜观察海马神经元超微结构的改变，ELISA法测定血清 NSE（神经元特异性烯醇化酶）浓度变化。结果丹参治疗组幼鼠电镜下可见海马神经元较轻的超微结构病变和血清NSE浓度在发作后相同时点均低于持续癫痫组。结论丹参对持续癫痫幼鼠脑神经元损伤具有一定的保护作用；血清神经元特异性烯醇化酶与持续癫痫幼鼠神经元损伤变化趋势基本一致，能作为判断脑神经元损伤及其恢复的有效指标。
关键词：丹参； 惊厥性脑损伤； 神经元特异性烯醇化酶
Protective Effect of Salvia miltiorrhiza Bge Against Seizure-induced Brain Injury in Young Rats
Abstract：ObjectiveTo evaluate the protective effect and mechanism of Salvia miltiorrhiza Bge(SMB) against seizure-induced cerebral neuron injury of premature rats.MethodsMegimide (20mg/kg) was injected into healthy infant rats(21d) to evoke status epilepticus(SE).The ultrastructure changes of the hippocampus neurons were observed under the electronic microscope.At the same time points,the level of neuron speertic enolale NSE in rat sera was tested with ELISA.ResultsThe hippocampus neurons of SE group rats,the mitochondria volume decreased,the matrix condensed,the ridge obscured or disappeared.Compared with the SE group, there was a significant improvement in nutron injury in SMB group.The SE group rats in the 72 h after seizures had a high level of NSE in sera.But the SMB group was lower.ConclusionSalvia miltiorrhiza Bge has a positive effect on the seizure-induced brain neuron injury of premature rats.The serum NSE may be an effective marker used to tell the existence of neuron injury and point out the recovery.
Key words：Salvia miltiorrhiza Bge; Brain neuron injuries; Neuron specific enolase
癫痫为小儿时期常见的神经系统疾病，长期的临床观察和流行病学调查发现，小儿更易发生癫痫持续状态（status epilepticus,SE）［1］。大量研究证实，癫痫发作尤其是癫痫持续状态，不仅可引起暂时性脑功能障碍，且可致严重的器质性脑损伤，进而引起学习、记忆及行为异常等严重后果。如何在癫痫发作后采取有效措施防治脑损伤已成为小儿神经领域关注的热点课题。本课题旨在探讨丹参对癫痫持续状态发作诱发的发育期幼鼠脑损伤是否具有保护作用及其可能的作用机制，为临床探索一种有效途径来防治惊厥性脑损伤提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物新生20 d清洁级 SD大鼠48只，雌雄各半，体重54～70 g，由山西医科大学实验动物中心提供。
1.1.2 药品和试剂、实验仪器美解眠针（50 mg/20 ml，上海第二军医大学朝晖制药厂，批号：021102）；丹参注射液（2 ml /支，上海中西药业有限公司新冈制药厂，每支相当于含原生药0.15 g，批号：020909）；神经元特异性烯醇化酶（NSE）ELISA试剂盒（军事医学科学院提供，批号：00612）；恒温水浴箱（上海器械七厂）、酶联仪（BJ600板式酶联仪）。
1.2 动物
1.2.1 动物模型制备及给药方法实验动物混合喂养1 d后，随机分为正常对照组、持续癫痫组（SE组）和丹参治疗组（SMB组），每组各16只。其中 SE组和丹参治疗组按20 mg/kg经背部皮下及腹腔注射［2］，若15 min内无惊厥发作，再按0.25~2.5 mg/次追加美解眠，至1 h内出现全身性惊厥大发作。正常对照组按同样方法注射等量生理盐水。按 Simialowski 6级评定法［3］评定惊厥发作，惊厥发作终止后30 min，丹参治疗组即刻按(3.5 ml/kg)，各组动物混合饲养，每日测量体重调整注射剂量，直至不同时间（惊厥后72 h，7 d）随机分批处死。更多论文资料尽在www.fw789.com
1.2.2 血清标本及脑组织取材方法实验动物用10%水合氯醛按400 mg/kg行腹腔注射麻醉，自左心室采血约2 ml。立即置入干燥试管中，静置约1 h，3 200 r/min，离心10 min，取上清液，-20℃分装冻存（注意不能溶血，所有溶血标本均应弃之。取血后行内灌注固定，迅速取出脑组织置于-4℃冰箱保存）。
1.2.3 观察指标海马神经元超微结构观察：取1 mm×1 mm×1 mm大小海马组织，修剪均匀，常规电镜标本制备，超薄片，铀铅染色，透射电镜观察神经元超微结构变化。NES浓度：每组各时点随机取5只实验鼠血清作 NSE-ELISA测定。
1.3 统计学处理所有定量指标均采取±s来表示。应用 SAS统计软件对实验数据进行统计学处理。设双侧 a=0.05为检验水准。
2 结果
2.1 海马电镜下超微结构观察正常对照组幼鼠海马神经元细胞规则，基质均匀，线粒体呈椭圆形，大小正常，嵴规则，粗面内质网结构清楚，核膜平滑，核呈圆形，常染色质分布均匀，核仁不明显。持续癫痫发作后72 h，SE组可见以海马 CA3区为主的神经元超微结构病变，主要表现为线粒体体积缩小，部分出现空泡，基质浓缩，嵴模糊不清或消失，高尔基复合体轻至中度扩张，丹参治疗组海马 CA3区为主的神经元超微结构病变明显轻于 SE组，表现为线粒体体积缩小，但基质、嵴均较清楚，高尔基复合体轻度扩张，而其他脑区未见类似神经元的超微结构病变。持续癫痫发作后7 d，SE组幼鼠海马神经元超微结构损伤稍有所缓解，而丹参治疗组神经元损伤有较好程度的修复。
2.2 血清神经元烯醇化酶浓度变化持续癫痫发作后72 h，SE组血清NSE浓度明显增高，与正常对照组及丹参治疗组相比有显著差异，在发作后7 d其浓度虽有所降低，但与其他两组相比无明显差异。然而，SE组在发作后72 h与7 d时的血清 NSE浓度变化有差异，说明血清 NSE浓度在脑神经元损伤发生的同时升高，且随着脑损伤发生后的时间延长而存在一个降低趋势；丹参治疗组在发作后72 h血清 NSE浓度明显低于 SE组，从分子水平说明了丹参对脑损伤具有一定的保护作用。
3 讨论
作为一种医学和神经专科的共同急症，SE造成脑损伤后，相对高的致障率和死亡率不容忽视，积极采取有效措施来防治癫痫持续状态后脑损伤有着重要的临床指导意义。神经元特异性烯醇化酶（NSE）是糖酵解途径的关键酶，特异性存在于神经元和神经外胚层组织，正常体液中含量甚微，脑损伤时神经细胞崩解，血脑屏障破坏，该酶进入脑脊液和血液中而致
摘要：目的探讨丹参对持续癫痫幼鼠脑神经元损伤可能具有的保护作用及其机制。方法美解眠诱发健康幼龄大鼠癫痫持续状态发作。随机分组后分批处死。电镜观察海马神经元超微结构的改变，ELISA法测定血清 NSE（神经元特异性烯醇化酶）浓度变化。结果丹参治疗组幼鼠电镜下可见海马神经元较轻的超微结构病变和血清NSE浓度在发作后相同时点均低于持续癫痫组。结论丹参对持续癫痫幼鼠脑神经元损伤具有一定的保护作用；血清神经元特异性烯醇化酶与持续癫痫幼鼠神经元损伤变化趋势基本一致，能作为判断脑神经元损伤及其恢复的有效指标。
关键词：丹参； 惊厥性脑损伤； 神经元特异性烯醇化酶
Protective Effect of Salvia miltiorrhiza Bge Against Seizure-induced Brain Injury in Young Rats
Abstract：ObjectiveTo evaluate the protective effect and mechanism of Salvia miltiorrhiza Bge(SMB) against seizure-induced cerebral neuron injury of premature rats.MethodsMegimide (20mg/kg) was injected into healthy infant rats(21d) to evoke status epilepticus(SE).The ultrastructure changes of the hippocampus neurons were observed under the electronic microscope.At the same time points,the level of neuron speertic enolale NSE in rat sera was tested with ELISA.ResultsThe hippocampus neurons of SE group rats,the mitochondria volume decreased,the matrix condensed,the ridge obscured or disappeared.Compared with the SE group, there was a significant improvement in nutron injury in SMB group.The SE group rats in the 72 h after seizures had a high level of NSE in sera.But the SMB group was lower.ConclusionSalvia miltiorrhiza Bge has a positive effect on the seizure-induced brain neuron injury of premature rats.The serum NSE may be an effective marker used to tell the existence of neuron injury and point out the recovery.
Key words：Salvia miltiorrhiza Bge; Brain neuron injuries; Neuron specific enolase
癫痫为小儿时期常见的神经系统疾病，长期的临床观察和流行病学调查发现，小儿更易发生癫痫持续状态（status epilepticus,SE）［1］。大量研究证实，癫痫发作尤其是癫痫持续状态，不仅可引起暂时性脑功能障碍，且可致严重的器质性脑损伤，进而引起学习、记忆及行为异常等严重后果。如何在癫痫发作后采取有效措施防治脑损伤已成为小儿神经领域关注的热点课题。本课题旨在探讨丹参对癫痫持续状态发作诱发的发育期幼鼠脑损伤是否具有保护作用及其可能的作用机制，为临床探索一种有效途径来防治惊厥性脑损伤提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物新生20 d清洁级 SD大鼠48只，雌雄各半，体重54～70 g，由山西医科大学实验动物中心提供。
1.1.2 药品和试剂、实验仪器美解眠针（50 mg/20 ml，上海第二军医大学朝晖制药厂，批号：021102）；丹参注射液（2 ml /支，上海中西药业有限公司新冈制药厂，每支相当于含原生药0.15 g，批号：020909）；神经元特异性烯醇化酶（NSE）ELISA试剂盒（军事医学科学院提供，批号：00612）；恒温水浴箱（上海器械七厂）、酶联仪（BJ600板式酶联仪）。
1.2 动物
1.2.1 动物模型制备及给药方法实验动物混合喂养1 d后，随机分为正常对照组、持续癫痫组（SE组）和丹参治疗组（SMB组），每组各16只。其中 SE组和丹参治疗组按20 mg/kg经背部皮下及腹腔注射［2］，若15 min内无惊厥发作，再按0.25~2.5 mg/次追加美解眠，至1 h内出现全身性惊厥大发作。正常对照组按同样方法注射等量生理盐水。按 Simialowski 6级评定法［3］评定惊厥发作，惊厥发作终止后30 min，丹参治疗组即刻按(3.5 ml/kg)，各组动物混合饲养，每日测量体重调整注射剂量，直至不同时间（惊厥后72 h，7 d）随机分批处死。更多论文资料尽在www.fw789.com
1.2.2 血清标本及脑组织取材方法实验动物用10%水合氯醛按400 mg/kg行腹腔注射麻醉，自左心室采血约2 ml。立即置入干燥试管中，静置约1 h，3 200 r/min，离心10 min，取上清液，-20℃分装冻存（注意不能溶血，所有溶血标本均应弃之。取血后行内灌注固定，迅速取出脑组织置于-4℃冰箱保存）。
1.2.3 观察指标海马神经元超微结构观察：取1 mm×1 mm×1 mm大小海马组织，修剪均匀，常规电镜标本制备，超薄片，铀铅染色，透射电镜观察神经元超微结构变化。NES浓度：每组各时点随机取5只实验鼠血清作 NSE-ELISA测定。
1.3 统计学处理所有定量指标均采取±s来表示。应用 SAS统计软件对实验数据进行统计学处理。设双侧 a=0.05为检验水准。
2 结果
2.1 海马电镜下超微结构观察正常对照组幼鼠海马神经元细胞规则，基质均匀，线粒体呈椭圆形，大小正常，嵴规则，粗面内质网结构清楚，核膜平滑，核呈圆形，常染色质分布均匀，核仁不明显。持续癫痫发作后72 h，SE组可见以海马 CA3区为主的神经元超微结构病变，主要表现为线粒体体积缩小，部分出现空泡，基质浓缩，嵴模糊不清或消失，高尔基复合体轻至中度扩张，丹参治疗组海马 CA3区为主的神经元超微结构病变明显轻于 SE组，表现为线粒体体积缩小，但基质、嵴均较清楚，高尔基复合体轻度扩张，而其他脑区未见类似神经元的超微结构病变。持续癫痫发作后7 d，SE组幼鼠海马神经元超微结构损伤稍有所缓解，而丹参治疗组神经元损伤有较好程度的修复。
2.2 血清神经元烯醇化酶浓度变化持续癫痫发作后72 h，SE组血清NSE浓度明显增高，与正常对照组及丹参治疗组相比有显著差异，在发作后7 d其浓度虽有所降低，但与其他两组相比无明显差异。然而，SE组在发作后72 h与7 d时的血清 NSE浓度变化有差异，说明血清 NSE浓度在脑神经元损伤发生的同时升高，且随着脑损伤发生后的时间延长而存在一个降低趋势；丹参治疗组在发作后72 h血清 NSE浓度明显低于 SE组，从分子水平说明了丹参对脑损伤具有一定的保护作用。
3 讨论
作为一种医学和神经专科的共同急症，SE造成脑损伤后，相对高的致障率和死亡率不容忽视，积极采取有效措施来防治癫痫持续状态后脑损伤有着重要的临床指导意义。神经元特异性烯醇化酶（NSE）是糖酵解途径的关键酶，特异性存在于神经元和神经外胚层组织，正常体液中含量甚微，脑损伤时神经细胞崩解，血脑屏障破坏，该酶进入脑脊液和血液中而致
